V prvej pol. 16. stor. sa najmä na východnom Slovensku a v stredoslovenských banských mestách, kde žilo najviac nemeckého obyvateľstva, začala šíriť z Nemecka Lutherova reformácia. Nové myšlienky prinášali väčšinou študenti, ktorí študovali na nemeckých univerzitách, a kupci. Po moháčskej bitke sa k reformácii pridávala aj šľachta, ktorá chcela rozdeliť (sekularizovať) cirkevný majetok. Aj veľká časť poddaných sa pridala k reformácii. No po prijatí zásady Cuíus regio, eius religio - Koho panstvo, toho náboženstvo v roku 1555 na ríšskom sneme v Augsburgu nútili poddaných vyznávať vieru zemepána.V bitke pri Moháči zahynula takmer celá cirkevná vrchnosť. Organizácia štátu i cirkvi bola celkom rozvrátená. Ani Habsburgovci, ktorí vždy stáli veme na strane Ríma, nemohli ostro zakročiť proti šíriacej sa reformácii. Na Slovensku svoju moc opierali najmä o meštianstvo, ktoré bolo oporou reformácie. Súhlasili preto s požiadavkami evanjelikov v mestách na Slovensku, ktoré predložili v pol. 16. stor. V tom čase sa hlásila k reformácii viac ako polovica farností. Evanjelická cirkev augsburského vyznania sa na Slovensku organizačne ustanovila pod ochranou palatína Juraja Turzu na synodách v Žiline (1610) a v Spišskom Podhradí (1614).Okrem umiernenejšej Lutherovej reformácie sa šírili aj jej radikálnejšie formy. Kalvinizmus prijala len malá časť Slovákov z juhovýchodného Slovenska. Ohlas našiel najmä medzi Maďarmi.Anabaptisti (novokrstenci) sa rozšírili na Spiši a najmä na západnom Slovensku, kde ich Slováci nazývali habánmi.Od 2. pol. 16. stor. sa aktivizuje aj katolícka cirkev. S podporou Habsburgovcov sa usiluje zastaviť vlnu protestantizmu a získať stratené pozície medzí veriacimi. Za arcibiskupa Mikuláša Oláha bol v jeho sídle v Tmavé založený kňazský seminár. V protireformačnom boji aktívne pôsobil aj mníšsky rád jezuitov v Tmavé (1561). Začal sa proces rekatolízácie.Reformácia i protireformácia využívali pre svoje vieroučné i kultúrne ciele nové európske myšlienkové prúdy - humanizmus a renesanciu. Obidve znepriatelené náboženské strany sa uchádzali o dušu veriaceho v jemu zrozumiteľnom národnom jazyku. Prudko sa začalo rozvíjať evanjelické i katolícke školstvo. V 17. stor. pôsobili na Slovensku dve katolícke univerzity (v Tmavé a Košiciach) a úroveň vysokej školy dosiahlo aj evanjelické kolégium v Prešove, kde pôsobili významní vzdelanci. Mnoho študentov zo Slovenska študovalo na zahraničných univerzitách v Prahe, Viedni, Krakove, či v Nemecku a Taliansku. Na obidvoch stranách sa prudko rozvíjala knižná kultúra a hudba, čím sa budovali základy národnej vzdelanosti. Veľkú zásluhu na šírení náboženských spisov, ale aj učebníc i diel so svetským obsahom mala kníhtlač. V Bardejove bola roku 1581 vytlačená prvá kniha v slovenčine - Lutherov katechizmus. Tlačiarne boli aj v Banskej Bystrici a Tmavé.Vzostup vzdelanosti a kultúry prispieval k formovaniu národného povedomia. Slováci sa začali vyčleňovať z rodiny slovanských národov a čoraz viac si uvedomovali používanie slovenčiny alebo slovakizovanej češtiny. Prejavilo sa v nich vedomé úsilie poznávať históriu í súčasnosť svojej krajiny a jej obyvateľov. Výraznejšie sa začala pociťovať snaha povýšiť svoje národné ,,ja" najmä voči Maďarom a Nemcom.